Thông tin kết quả nhiệm vụ KH&CN

Nghiên cứu tạo thư viện chứng dương cho xét nghiệm sinh học phân tử phát hiện các đột biến gen phục vụ chẩn đoán bệnh Thalassemia (22/11/2023)

Thalassemia là bệnh thiếu máu di truyền phổ biến nhất thế giới với tỉ lệ mắc ở hai giới là tương đương nhau. Hằng năm có hàng trăm đứa trẻ sinh ra bị thiếu mãu do mặc căn bệnh này. Bệnh đặt biệt phổ biến ở một số quốc gia như Itali, Hilap, Trung Đông, châu Phi, khu vực Nam Á và Đông Nam Á. Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ người mặc bệnh Thalassemia cao nhất thế giới, dao động từ 10-20%. Mỗi năm ước tính có khoảng 2,000 trẻ em sinh ra mắc bệnh Thalassemia tạo thành gánh nặng cho gia và toàn xã hội, ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng dân số Việt Nam. Việc chẩn đoán sớm tình trạng bệnh có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với những bệnh nhân Thalassemia nặng, sống lệ thuộc truyền máu ở giai đoạn nhũ nhi bởi khi đó bệnh chưa diễn tiến nặng. Nếu pháp hiện sớm, những người bệnh này có cơ hội được điều trị trước khi những biến chứng nghiêm trọng của bệnh xuất hiện, nhờ đó đảm bảo chất lượng cuộc sống và kéo dài tuổi thọ của họ một cách đáng kể. Đặc biệt chuẩn đoán phát hiện chuẩn đoán gen gây bệnh Thalassemia là cơ sở để thực hiện tư vấn di truyền trước sinh và tiền hôn nhân nhằm quản lý tốt nguồn gen bệnh, ngăn chặn sự phát tán nguồn gen xấu ra cộng đồng, tiến tới loại bỏ hẳn nguồn gen xấu mang nguy cơ suy thoái giống nòi ra khỏi cộng đồng.

Hình ảnh điện di diện DNA tổng số.

Hiện nay tại Việt Nam, trong lĩnh vực chẩn đoán phân tử nói chung, cho các đột biết gây bệnh thalassemia nói riêng, vẫn chưa có một nghiên cứu nào được thực hiện nhằm tạo ra nguồn chứng dương theo con đường tái tổ hợp. Các kỹ thuật tách dòng gen được thực hiện với mục đích phân lập gen đích phục vụ quá trình nghiên cứu cơ bản hoặc làm sản phẩm trung gian trong quá trình tạo các sản phẩm tái tổ hợp như vaccine, thuốc. Nguồn chứng dương vẫn dựa trên từ mẫu máu của bệnh nhân. Đối với một số biến hiếm phải nhập khẩu từ nước ngoài, có giá thành rất cao, chi phí nuôi cấy, bảo quản cao và thường thoái hóa sau một thời gian lưu trữ. Ở các nước phát triển, nguồn chứng dương sử dụng là các dòng tế bào (cell line) mang đột biến. Tuy nhiên các tế bào dòng này rất đắt, khó bảo quản và lưu trữ. Vì vậy, yêu cầu đặt ra là cần phải chủ động nguồn chứng dương chất lượng ổn định, giá thành hợp lý để đảm bảo chất lượng xét nghiệm. 

Với mục tiêu đề ra, Ủy ban nhân dân thành phố Hải Phòng đã phê duyệt triển khai đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ cấp thành phố “Nghiên cứu tạo thư viện chứng dương cho xét nghiệm sinh học phân tử phát hiện các đột biến gen phụ vụ chuẩn đoán bệnh Thalassemia” do TS Bạch Thị Như Quỳnh - Trưởng bộ môn Sinh học phân tử, Trường Đại học Y Dược Hải Phòng cùng các cộng sự thực hiện. Đề tài được nghiệm thu ngày 27/11/2021 tại Sở Khoa học và Công nghệ.

Nhóm nghiên cứu đã tiến hành sàng lọc 14 loại đột biến gen gây bệnh Thalassemia trên 200 bênh nhân nghi nhiễm Thalassemia tại Viện Huyết học truyền máu trung ương. Kết quả thu được: sàng lọc được đủ 14 loại đột biến gây bện thalassemia, 6 đột biến alpha thalassemia và 8 đột biến beta thalassemia từ 1456 bệnh phẩm. Tổng hợp được 14 đoại gen đặc hiệu cho 14 loại đột biến gây bệnh thalassemia. Tạo dòng 14 loại chứng dương” 14 loại plamid tái tổ hợp mang 14 loại gen đột biến gây bệnh thalassemia; 14 dòng tế bào chứa 14 loại gen đột biến gây bện thalassemia. Các dòng tế bào tái tổ hợp được tiến hành chọn lọc bằng 3 phương pháp; trên môi trường nuôi cấy LB có bổ sung Amp+Xgal+IPTG; sử dụng enzyme cắt giói hạ và PCR. Kết quả chọn lọc bằng hai phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn và PCR tương đồng và cho hiệu suất tương đương nhau. Thực hiện giải trình tự gen 14 loại đột biến gen gây bệnh thalassemia tương ứng với mỗi dòng tế bào. So sánh trình tự gen đột biến từ các dòng tái tổ hợp với trình tự gen đột biến tương ứng  trên NCBI, đạt độ tướng đồng 99-100%; các dòng tế bào có sức sống ổn định sau 10 lần cấy chuyển liên tiếp và sau 3 tháng bảo quản tại -80⁰C không xẩy ra hiện tượng đào thải gen nhận.

Theo đó, nghiên cứu chỉ ra được 14 dòng tế bào tái tổ hợp chứa 14 loại chứng dương tương ứng gửi kiểm nghiệm tại Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương khẳng định nguồn chứng dương được tạo ra bằng con đường tái tổ hợp ổn định và đặc hệu hơn khi so sánh với đối chứng dương là mẫu máu người mang gen bệnh. Nguồn chứng  dương táo tổ hợp hoàn toàn có thể thay thế cho nguồn chứng dương tự nhiên để ứng dụng trong xét nghiệm chuẩn đoán phân tử.

Đồng thời, nhóm nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình tạo thư viện chứng dương đảm bảo tạo ra các plasmid tái tổ hợp mang trình tự gen đột biến gây bệnh thalassemia; tạo ra dòng tế bào tái tổ hợp chứa đột biết mong muốn; Xây dựng quy trình nuôi cấy và bảo quản tế bào chi tiết, đảm bảo sức sống và bảo toàn nguồn gen trong tế bào. Các dòng tế bào được tạo ra từ quy trình này chứa các gen đột biến có tính bảo toàn sau 10 lần cấy chuyển, đảm bảo tính ổn định theo chu kỳ hoạt hóa sau 3 tháng lưu giữ tại nhiệt độ -80⁰C.

Việc thực hiện đề tài giúp ngành y tế xây dựng xây dựng được thư viện chứng dương cho xét nghiệm chẩn đoán các đột biến gây bệnh thalassemia và được quản lý trên phần mềm Biobank, các mẫu được mã hóa và cất giữ theo sơ đồ lưu mẫu trên phần mềm. Kết quả nghiên cứu khi ứng dụng trong thực tế sẽ góp phần nâng cao chất lượng công tác chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cho nhân dân thành phố Hải Phòng./. 

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài tại Trung tâm Thông tin, Thống kê khoa học và công nghệ Hải Phòng./.