Thông tin kết quả nhiệm vụ KH&CN

Nghiên cứu xây dựng quy trình phân lập thể thực khuẩn (Phage) bản địa để phòng và trị bệnh hoại tử gan tụy trên tôm thẻ chân trắng tại Hải Phòng (18/03/2024)

Bệnh hoại tử gan tụy (AHPND) trên tôm do vi khuẩn Vibrio spp. (V.parahaemolyticus, V. harveyi…) gây ra, tỷ lệ chết có thể lên đến 100%. Để trị bệnh, người dân dùng kháng sinh, tuy nhiên nhiều nghiên cứu chỉ ra sự kháng kháng sinh của vi khuẩn Vibrio spp. gây bệnh hoại tử gan tụy. Chính vì vậy, việc có một phương pháp hữu hiệu và an toàn để phòng trị bệnh AHPND là rất cần thiết.

Thể thực khuẩn (phage) là một loại virus đặc biệt chuyên tấn công vi khuẩn, sống ký sinh và phá vỡ tế bào vi khuẩn. Phage đã chứng minh được hiệu quả trong phòng và trị bệnh do vi khuẩn gây ra, tiêu diệt cả vi khuẩn kháng kháng sinh và không ảnh hưởng đến sức khỏe của cá tôm. Trước thực tế đó, TS. Lê Tuấn Sơn cùng các cộng sự Trung tâm Quan trắc Môi trường biển (Viện Nghiên cứu Hải sản) triển khai đề tài cấp thành phố “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân lập thể thực khuẩn (phage) bản địa để phòng và trị bệnh hoại tử gan tụy trên tôm thẻ chân trắng tại Hải Phòng”, thực hiện báo cáo kết quả tại Sở Khoa học và Công nghệ Hải Phòng vào tháng 12/2023. Đề tài tập trung nghiên cứu phân lập vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tuỵ, xây dựng quy trình phân lập phage bản địa và quy trình sản xuất phage dạng dung dịch đạt mật độ 107 PFU/ml để phát triển nuôi tôm bền vững. Việc sử dụng phage để phòng, trị bệnh hoại tử gan tụy sẽ hạn chế sử dụng kháng sinh, giúp nông dân và doanh nghiệp nuôi tôm có quy trình nuôi tôm ứng dụng phage theo hướng an toàn. 

Chuẩn bị và bố trí thí nghiệm tiêm tôm tại Trạm Nghiên cứu biển Đồ Sơn - Viện Tài nguyên và Môi trường biển.

Sau 02 năm nghiên cứu, bên cạnh các vấn đề tổng quan; đề tài hoàn thành mục tiêu khi phân lập được 09 vi khuẩn DK1, DK2, DK3, TC1, TC2, DK3, TNI, TN2 và TN3 tại vùng nuôi tôm của Dương Kinh, Hải An và Thuỷ Nguyên của Hải Phòng. Kích thước của các chủng từ 0,5 x 1,66 μm đến 0,5 x 2,42 μm, trong đó DK2 và TC1 gây bệnh hoại tử cho tôm cho tôm bằng phương pháp tiêm với tỷ lệ tôm chết cộng dồn là 53,3 - 60,1% sau 48 giờ. Tôm chết tại lô tiêm với TC1 và DK2 được gửi Chi cục Thú y vùng II để kiểm định và đã xác nhận DK2 và TC1 là vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tuỵ.

Phương pháp tách chiết DNA tổng số có hiệu chỉnh được nhóm nghiên cứu sử dụng. Kết quả tách chiết DNA của vi khuẩn DK1, DK2, TC1, TC2, TN1 và TN2 đạt tỷ lệ OD260/OD280 = 1,9 - 2,1, với nồng độ DNA từ 48 - 1.392 ng/uL đã chứng tỏ DNA tổng số tách chiết được là sạch, rất ít đứt gãy, đảm bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả định danh 16s rDNA chỉ ra, DK2 là vi khuẩn V. parahaemolyticus (tỷ lệ tương đồng 99,86%) và TC1 là vi khuẩn V. azureus (tỷ lệ tương đồng 100%). V.azureus TC1 gây bệnh hoại tử gan là một phát hiện mới. 

Để phân lập chủng thể thực khuẩn bản địa, nhóm nghiên cứu sử dụng 22 mẫu nước tại khu nuôi Hải Phòng. Kết quả đã phân lập được 05 thể thực khuẩn thuộc họ Myoviridae (phage 2, phage 2- 2, phage 3, phage 2-1 và phage mix), trong đó phage 2 và phage 3 có khả năng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy V. parahaemolyticus DK2 và V. azureus TC1. Thể thực khuẩn phage 2, phage 3, phage 2-1 và phage 2-2 được đánh giá là an toàn với tôm và an toàn với vi khuẩn khác. Vi khuẩn đề kháng phage là an toàn với tôm, độc lực của vi khuẩn đề kháng phage là yếu. Phage 2 đã tiêu diệt 77,4% vi khuẩn Vibrio 5-2 và 80,5% vi khuẩn V. parahaemolyticus A23 - DK2 sau 7,5 giờ thí nghiệm. Nghiên cứu cũng cho thấy không có sự khác biệt với các MOI khác nhau khi ứng dụng phương pháp cho ăn phage. Phương pháp tiêm đạt hiệu quả phòng trị bệnh của phage với MOI = 10.

Biểu hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm.

Bên cạnh đó, nhóm tác giả cũng nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm thể thực khuẩn dạng dung dịch. Theo đó, môi trường dung dịch tryptone được lựa chọn cho sản xuất thể thực khuẩn; Nhiệt độ phù hợp cho tăng sinh thể thực khuẩn cao là 30°C; Thời gian thu hoạch phage thích hợp là 5-7giờ. Nồng độ phage không thay đổi đáng kể khi bổ sung Chloroform 1%, 2% và vi khuẩn bị bất hoạt bởi Chloroform 2% ở điều kiện nhiệt độ phòng và 4°C. Mật độ phage sau 5 giờ tăng sinh tại MOI 0,1 và 1 là cao hơn so với MOI 0,05. Với nghiên cứu sản xuất 200 ml và 2-3 lít phage của đề tài, đề xuất không sử dụng MOI 10 vì yêu cầu một lượng phage ban đầu quá cao và như vậy không hiệu quả.

Đánh giá về giá thành để sản xuất phage cho thấy, giá thành càng giảm khi sản xuất với lượng lớn. Nếu chỉ sản xuất 1 lít chế phẩm phage thì giá thành là 237.406 đồng cho 100 ml. Nếu sản xuất với lượng lớn (10 lít), giá thành cho sản xuất 100ml là 49.881 đồng. Hiện tại ở Việt Nam, chưa có giá thành cụ thể của chế phẩm phage trị bệnh hoại tử gan tuỵ trên tôm, nên đề tài không thể so sánh giá thành sản xuất.

Ngoài ra, đề tài cũng đề xuất xây dựng 02 quy trình. Trong đó quy trình phân lập phage bản địa để phòng trị Vibrio spp gồm các bước: Thu mẫu nước; Tăng sinh mẫu bậc 1, lọc dịch 1 và lựa chọn vòng vô khuẩn; Tăng sinh bậc 2 từ đốm tan và dịch lọc 2; Tăng sinh bậc 3 từ đốm tan và dịch lọc 3; Tăng sinh bậc 4 từ đốm tan và dịch lọc 4; TEM và định danh; Lưu và bảo quản chủng phage. Với quy trình sản xuất phage dạng dung dịch đạt mật độ 10⁷PFU/ml, các bước bao gồm: Tăng sinh vi khuẩn 20mL; Tăng sinh thể thực khuẩn 20mL lần 1, 2 và 3 để thu được 20mL phage có nồng độ ≥107 PFU/mL; Tăng sinh thể thực khuẩn 200mL để thu được 200mL phage có nồng độ ≥107 PFU/mL; Tăng sinh phage 2-3L; Thu hoạch phage bằng lọc 0,22 um hoặc chloroform; Lưu và bảo quản phage.

Thành công của kết quả nghiên cứu giúp hạn chế việc sử dụng kháng sinh trong nuôi tôm, góp phần phát triển nghề nuôi tôm theo hướng an toàn; đồng thời được đánh giá là có tiềm năng trong việc phát triển thị trường sản xuất và kinh doanh chế phẩm phage trị bệnh hoại tử gan tụy trên đối tượng tôm nuôi. 

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu của Đề tài tại Trung tâm Thông tin, Thống kê khoa học và công nghệ Hải Phòng./.