Thông tin kết quả nhiệm vụ KH&CN

Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo hợp chất mới có hoạt tính kháng sinh từ xạ khuẩn biển thành phố Hải Phòng (03/01/2025)

Xạ khuẩn (Actinomycetes hay Actinobacteria) là ngành đặc biệt thuộc vi khuẩn Gram dương, có sự phát triển theo cấu trúc khoang/sợi (filamentous growth) và đôi lúc giống như nấm. Xạ khuẩn phân bố rộng khắp trên cả lục địa và dưới nước. Chúng có đặc điểm hoá sinh học đặc biệt, tạo ra lượng lớn các loại hợp chất tự nhiên, rất nhiều trong số đó có hoạt tính sinh học mạnh như kháng sinh hoặc các hoạt tính dược học khác. Xạ khuẩn biển là xạ khuẩn có nguồn gốc từ biển, có sự khác biệt về kiểu hình với xạ khuẩn trên cạn. Phân lập xạ khuẩn biển là khâu quan trọng trong quá trình tạo nguồn nguyên liệu nghiên cứu từ các mẫu biển đã thu thập. Phân lập xạ khuẩn biển là quá trình tách riêng các xạ khuẩn từ quần thể ban đầu trong các mẫu biển, tạo thành các chủng xạ khuẩn thuần khiết (clon) được gọi là khuẩn lạc trong phòng thí nghiệm. Khi phân lập các chủng xạ khuẩn biển từ các vùng biển nghiên cứu, cần sử dụng các điều kiện phù hợp với môi trường sống bản địa để nâng cao hiệu quả phân lập. Một số yêu cầu bắt buộc đối với môi trường phân lập và nuôi cấy xạ khuẩn biển là: Nồng độ muối, hàm lượng chất dinh dưỡng, điều kiện nhiệt độ, pH…. Bên cạnh đó, cần thực hiện lựa chọn nguồn để sàng lọc, xử lý mẫu ban đầu như làm khô, sưởi ấm… để kích thích sự phát triển của xạ khuẩn.

Với mục tiêu xây dựng quy trình tạo cặn chiết có hoạt tính kháng sinh từ xạ khuẩn biển và xây dựng quy trình tách và tinh chế hợp chất mới có hoạt tính kháng sinh từ xạ khuẩn biển Hải Phòng. Năm 2021, Trường Đại học Y Dược Hải Phòng được Ủy ban nhân dân thành phố phê duyệt triển khai nhiệm vụ khoa học và công nghệ: “Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo hợp chất mới có hoạt tính kháng sinh từ xạ khuẩn biển thành phố Hải Phòng”.

Nghiên cứu tổng quan cho thấy, xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt, chúng có khuẩn lạc khô và đa số có dạng hình phóng xạ (actino-) nhưng khuẩn thể lại có dạng sợi phân nhánh như nấm (myces). Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, thường có tỷ lệ G+C trong DNA cao hơn 55%. Trong số 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn. Xạ khuẩn có danh pháp khoa học là Actinobacteria, tiếng Anh - Actinomycetes. Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên như trong đất, nước ngọt, nước biển và trầm tích biển. Khoảng 50.000 sản phẩm tự nhiên đã được phát hiện từ vi sinh vật, hơn 10.000 sản phẩm trong số đó có hoạt tính sinh học. Hiện nay, hơn 1000 sản phẩm từ vi sinh vật đang được sử dụng làm thuốc kháng sinh, chất chống u và hóa chất nông nghiệp. Trong số các vi sinh vật khác nhau, xạ khuẩn là nguồn sản xuất lớn nhất của các chất chuyển hóa thứ cấp. Trong số các hợp chất Actinomycetales này, 75% là từ Streptomyces và 25% là từ xạ khuẩn hiếm.

Hệ thống lên men quy mô 50L.

Sau 33 tháng triển khai, nghiên cứu đã đạt được các kết quả sau:

Một là, đã tiến hành thu thập mẫu biển ở 2 vùng biển Bạch Long Vĩ với 116 mẫu và 115 mẫu thu được từ khu vực đảo Cát Bà, tổ chức phân lập xạ khuẩn biển từ các mẫu biển đã thu thập. Kết quả đã phân lập và xác định hoạt tính kháng vi sinh vật 60 chủng xạ khuẩn từ vùng biển Cát Bà và Bạch Long Vĩ Hải Phòng.

Hai là, sàng lọc và định danh được 08 chủng xạ khuẩn biển thành phố Hải Phòngcó thành phần hóa học tiềm năng, chứa các hợp chất hữu cơ khác với các hợp chất cyclodipetid có hoạt tính kháng sinh đã biết bao gồm: Bạch Long Vĩ G551 (6/10), G566 (6/10), G571 (7/10) và G577 (7/10); Cát Bà: G591 (6/10), G595 (10/10), G598 (8/10) và G605 (6/10). Kết quả khẳng định chủng G595 rất có tiềm năng sản xuất ra hợp chất mới có hoạt tính kháng sinh. Phân lập, xác định cấu trúc hóa học và hoạt tính kháng sinh của 12 hợp chất từ chủng xạ khuẩn biển G595 trong đó có 1 hợp chất mới.

Ba là, xây dựng được quy trình nuôi cấy chủng xạ khuẩn biển G595 quy mô 50L, áp dụng cho nuôi cấy chủng xạ khuẩn biển G595 nhằm tạo ra dịch nuôi có hoạt tính kháng sinh đối với vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm và nấm. Quy trình gồm 5 bước chính, bao gồm:

- Bước 1. Kiểm tra thuần chủng: Chuẩn bị đĩa petri chứa 10 mL môi trường nuôi ISP2 (rắn), pH = 7,2 cấy chủng giống G595 lên đĩa petri, nuôi vô trùng ở 28⁰C trong 7 ngày. Kiểm tra độ thuần khiết của chủng xạ khuẩn. Khuẩn lạc của chủng G595 có màu sắc, bề mặt, hình dạng đặc trưng, không có các màu sắc và sắc tố lạ.

- Bước 2. Hoạt hóa chủng: Dùng que cấy lấy 3 - 5 khuẩn lạc riêng rẽ từ bước kiểm tra sự thuần khiết của chủng, cấy vào bình tam giác 50 mL chứa 20 mL môi trường A1+ (lỏng). Nuôi lắc 100 vòng/phút ở 28⁰C trong 7 ngày.

- Bước 3. Nhân giống cấp 1: Chuyển 10 mL dịch nuôi hoạt hóa vào bình tam giác 500 mL chứa 200 mL môi trường mới ISP2 lỏng (với tỉ lệ bổ sung giống 5 %). Nuôi lắc 100 vòng/phút ở 28 oC trong 7 ngày.

- Bước 4. Nhân giống cấp 2: Chuyển 150 mL dịch nuôi cấy từ bình tam giác nhân giống cấp 1 vào hai bình tam giác (thể tích 5.000 mL có chứa 3.000mL môi trường ISP2 đã chuẩn bị trước), với tỉ lệ bổ sung giống là 5%, Nuôi lắc 100 vòng/phút ở 28⁰C trong 7 ngày.

- Bước 5. Nuôi cấy (lên men).

Bốn là, xây dựng quy trình công nghệ tạo cặn chiết từ dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn biển G595 quy mô 50 L. Quy trình sử dụng phương pháp chiết rắn lỏng sử dụng pha rắn là XAD-16, dung môi rửa giải là MeOH. Quy trình áp dụng cho tạo cặn chiết từ dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn biển G595 nhằm thu được cặn chiết có hoạt tính kháng sinh đối với vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm và nấm. Quy trình gồm 5 bước chính, bao gồm:

- Bước 1. Siêu âm phá vỡ tế bào xạ khuẩn: Dịch nuôi cấy thu nhận từ quy trình nuôi cấy quy mô 50 L được siêu âm ở 40⁰C trong 30 phút. Dịch sau siêu âm được thu nhận, bảo quản.

- Bước 2. Lọc thô: Dịch sau siêu âm được lọc qua màng lọc cellulose/polypropylene 5 μm để loại bỏ mảnh tế bào, tạp chất và các chất rắn chưa tan, sau khi sinh khối vi khuẩn đã được phá vỡ bằng siêu âm ở áp suất thường. Có thể dùng thiết bị tạo chênh lệch áp suất để tăng tốc độ lọc (nếu cần). Thu nhận dịch lọc.

- Bước 3. Hấp phụ: Dịch lọc được đưa từ từ qua cột chứa XAD-16, áp suất thường. Các hợp chất hữu cơ trong dịch lọc sẽ được hấp phụ lên XAD-16 trong khi các tạp, hợp chất vô cơ đi ra khỏi cột. Thu nhận dịch lọc đi qua cột để xử lý.

- Bước 4. Rửa giải: Chất hữu cơ hấp phụ trên XAD-16 được rửa giải ra khỏi cột bằng dung môi 50L MeOH, quá trình rửa giải được lặp lại 3 lần. Thu nhận dịch MeOH đi qua cột.

- Bước 5. Cất loại dung môi: Dịch MeOH đi qua cột chứa các hợp chất hữu cơ nội bào, ngoại bào do G595 sản xuất. Sử dụng máy cất loại dung môi dưới áp suất giảm, ở 40⁰C để loại dung môi MeOH, thu cặn chiết (ký hiệu MeOH_G595).

Năm là, xây dựng được quy trình tách và tinh chế hợp chất mới có hoạt tính kháng sinh từ xạ khuẩn biển Hải Phòng.Quy trình này áp dụng cho tách và tinh chế hợp chất mới có hoạt tính kháng sinh từ chủng xạ khuẩn biển Hải Phòng G595 nhằm thu được hợp chất mới (oxaliterpen G) có hoạt tính kháng sinh đối với vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm và nấm. Quy trình công nghệ tách và tinh chế hợp chất mới có hoạt tính kháng sinh từ xạ khuẩn biển Hải Phòng gồm 2 công đoạn chính:

- Công đoạn 1: Tạo cặn chiết EtOAc từ cặn chiết tổng (MeOH), gồm 2 bước:

(1) Hòa tan cặn chiết MeOH với nước (500 mL) sau đó chiết với dung môi CH2Cl2 (200 mL x 5 lần). Thu nhận pha nước.

(2) Chiết dịch nước thu được ở bước 1 với dung môi EtOAc (200 mL x 5 lần), thu nhận pha EtOAc, cất loại dung môi, thu được cặn chiết EG595.

- Công đoạn 2: Tách và tinh chế hợp chất mới từ EG595:

(1) Thu nhận các phân đoạn hữu cơ, khảo sát, đánh giá, ghi lại kết quả, thu nhận phân đoạn…

(2)Tiến hành sắc ký cột hở, Silica gel pha thường, và hệ dung môi CH2Cl2/acetone (100:1,50:1, 20:1, 10:1, v/v). Thu nhận phân đoạn F8.1

(3)Tiến hành sắc ký cột hở Silica gel pha thường phân đoạn F8.1, sử dụng hệ dung môi: n-hexane/EtOAc 5/1. Thu nhận phân đoạn F8.1.2

(4)Tiến hành sắc ký cột lọc Sephadex LH-20 với hệ dung môi MeOH / CH2Cl2 = 8/2. Sản phẩm của bước 2.4 là chất mới G595-8 (oxaliterpen G).

Quy trình nuôi cấy và tách chiết các hợp chất có hoạt tính kháng sinh từ xạ khuẩn biển được xây dựng ở Việt Nam nhằm phát triển sản phẩm có hoạt tính kháng sinh. Bên cạnh đó, đề tài còn tạo ra bộ sưu tập các chủng xạ khuẩn biển có nguồn gốc từ vùng biển thành phố Hải Phòng. Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đóng góp vào bức tranh tổng thể về nguồn lợi sinh vật biển của quần đảo Cát Bà và đảo Bạch Long Vỹ, từ đó góp phần định hướng trong việc bảo tồn, phát huy và sử dụng hiệu quả nguồn lợi sinh vật biển trong phát triển kinh tế địa phương. Bộ sưu tập các chủng xạ khuẩn biển Hải Phòng là nguồn gen, nguồn nguyên liệu quý; các quy trình đã xây dựng là cơ sở để thực hiện các bước tiếp theo trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc, sản phẩm chăm sóc sức khỏe mới có nguồn gốc từ biển. Giúp khai thác hiệu quả nguồn lợi địa phương, phát triển kinh tế biển. Đề tài góp phần đào tạo, nâng cao năng lực nghiên cứu khoa học cho cán bộ, sinh viên, học viên của Trường Đại học Y Dược Hải phòng, từ đó nâng cao năng lực khám chữa bệnh cho người dân thành phố và từng bước góp phần đưa Hải Phòng thành một trong những trung tâm nghiên cứu, khoa học và công nghệ biển của cả nước triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cho người dân thành phố nói riêng và thị trường nội địa nói chung. 

Có thể tìm đọc toàn văn Báo cáo kết quả nghiên cứu dự án tại Trung tâm Thông tin, Thống kê khoa học và công nghệ Hải Phòng./.